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免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)操時的幾大步驟說明
發(fā)布時間： 2022-10-09 點(diǎn)擊次數(shù)： 740次對于免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，我們拿脂質(zhì)體為例，其作為體內(nèi)和體外輸送載體的工具，已經(jīng)研究的十分廣泛，中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA，借助脂質(zhì)膜將DNA導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)。帶正電的陽離子脂質(zhì)體，DNA并沒有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負(fù)電的DNA自動結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物，從而吸附到帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面，經(jīng)過內(nèi)吞被導(dǎo)入細(xì)胞。具體實(shí)操時的步驟如下：1.細(xì)胞培養(yǎng)：取6cm細(xì)胞皿，向每孔中加入2mL含1~2×105個細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃二氧化碳培養(yǎng)密度至40%~60%，密度過大，轉(zhuǎn)染后不利篩選細(xì)胞。2.轉(zhuǎn)染液在EP管中制備(為轉(zhuǎn)染每一個孔細(xì)胞所用的量)：A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋1ug質(zhì)粒DNA；B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋2ul脂質(zhì)體。分別將A液與B液輕彈混勻，靜置5分鐘。3.吸取B液加入至A液中，輕彈混勻。室溫中置10-15分鐘。4.轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備：用1mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次，再加入4mL不含血清培養(yǎng)液。5.轉(zhuǎn)染：把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中，搖勻，37℃恒溫箱置6~24小時，吸除無血清轉(zhuǎn)染液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。6.瞬時轉(zhuǎn)染后，可在48-72h細(xì)胞長滿之后，提取細(xì)胞蛋白或者RNA，驗(yàn)證敲減/過表達(dá)效率。
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